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Cell:利用蛋白质组学技术揭示转移性黑色素瘤患者对免疫疗法治疗失败的机理
时间:2019-09-19   浏览:405次

     近日,一项刊登在国际杂志Cell上的研究报告中,来自特拉维夫大学的研究人员通过研究解释了为何超过一半的转移性黑色素瘤患者对癌症免疫疗法没有反应,这项研究中,为了更好地理解癌细胞对疗法产生耐受性的分子机制,研究人员利用蛋白质组学技术分析了来自116名患者机体的肿瘤样本;随后进行大量计算分析来识别两组患者机体中蛋白质的差异;蛋白质组的比较能帮助识别出对免疫疗法反应和无反应组患者机体的主要差异。研究结果发表在2019年9月19日的权威杂志 Cell 上。

                 
为了鉴定与免疫治疗反应相关的蛋白质网络,研究者收集了116个IV期黑色素瘤样本队列,包括42例接受TIL治疗的患者和74例接受抗PD1治疗的患者,并进行了非靶向的基于MS的蛋白质组学分析。我们将每个队列分为两个主要的响应者组(包括部分和完全响应者; n = 61)和不响应者(进行性疾病; n = 48)。 PD1队列包括其他疾病稳定的患者(n = 7)(图1A)。对患者临床参数的检查表明,有反应者和无反应者在总体生存率上存在非常显着的差异(图1B)。年龄和BRAF突变状态在两组之间均无显着差异。
                                               图1:Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy
 
      对于蛋白质组学分析,研究者解剖了> 80%肿瘤细胞的黑色素瘤区域,然后在基于细胞培养(SILAC)的高分辨率LC-MS / MS分析中用氨基酸进行了稳定的同位素标记。为了获得准确的蛋白质组定量,采用了一种超级SILAC混合物,该混合物由5种SILAC标记的黑色素瘤细胞系组成,可作为归一化的参考。检验super-SILAC标准物与肿瘤蛋白的比例显示出高度的一致性,反映出其作为内标物的适用性(图S1D)。然后将混合物以1:1的蛋白质比例掺入每个黑色素瘤样品中,以用作定量参考。合并的蛋白质裂解物经胰蛋白酶消化并分级分离,然后在Q-Exactive Plus或HF质谱仪上进行高分辨率LC-MS / MS分析(图1C)。总体上,对10,376个非冗余蛋白质组进行了量化(肽和蛋白质水平的假发现率[FDR]为1%);响应者和非响应者之间的覆盖范围没有重大差异(图1D-1E)。

      接下来,研究者生物信息学分析检查了每种疗法中反应者和非反应者之间的功能差异。首先在名义p值(p值<0.05)下进行了低严格度Student t检验,并在TIL和anti-PD1队列中分别发现414和636个差异表达蛋白(DEP)。然后,我们根据KEGG路径注释构建了蛋白质突变体,以将DEP聚类,并在两种治疗方法的图谱之间发现了惊人的相似之处(图2A)。在这两种情况下,应答者组均以较高水平的代谢蛋白为主,而非应答者则为剪接体和RNA代谢相关蛋白为主。除代谢类别外,来自两个数据集的应答者均具有更高比例的抗原呈递相关蛋白以及信号传导相关类别(mitogen-activated protein kinase [MAPK], nuclear factor-κB [NF-κB], and RAS信号通路),所有这些在黑素瘤和免疫治疗反应中均起重要作用。     

                        图2: 免疫疗法反应者与非反应者之间的功能差异分析

 而后,为了减少对特定蛋白质的广泛途径并确定反应的最小蛋白质特征,研究者又采用了将基于支持向量机(SVM)的分类与基于ANOVA的特征选择嵌入在递归交叉验证程序中的STAR方法来鉴定免疫治疗反应的蛋白质标记物。对于TIL队列,此过程产生了8个蛋白的特征;响应者中有6个高于非响应者,其中两个较低(图3A)。签名提供了根据主成分分析(PCA)中第一个成分的不同组之间的出色分离效果(图S3A),并且接收者操作特征(ROCs)曲线对曲线下的面积(AUC)表现出很高的预测灵敏度和特异性)的0.85(图S3B)。应用于抗PD1队列的相同步骤导致15种蛋白质标记,响应者组的所有蛋白质均高于非响应者组,ROC曲线的AUC为0.77(图3B,S3C和S3D)。比较这两个特征表明,尽管两种治疗的反应谱在功能上相似,但它们之间没有重叠。 TIL队列包括与脂肪酸和酮体代谢有关的蛋白质,ACOT1 / ACOT2,ACAT1和HADHA。抗PD1信号由多种抗原呈递相关蛋白组成,包括主要的组织相容性复合物(MHC)I类分子(人白细胞抗原[HLA] -A,HLA-C和B2M),MHC II类分子伴侣CD74 ,抗原肽转运蛋白(TAP1和TAP2),TAPBP(介导HLA和肽转运蛋白之间的相互作用)和蛋白酶体亚基PSME1。值得注意的是,在结合所选基线临床信息的TIL数据集上运行算法时,唯一优于蛋白质组学分类器的功能是输液袋中CD8细胞的数量。排在第二位的临床特征是血浆LDH水平,远低于TIL和抗PD1数据集中的标志蛋白(表S3A和S3B)。

                         图 3Protein Signatures of Response to Immunotherapy

     最后,作者又分别用了小分子抑制剂dichloroacetate (DCA))与基因编辑CRISPR-Cas9 系方法对鉴定出来的差异标志蛋白进行功能验证。综合实验结果,得出:116种黑色素瘤肿瘤的蛋白质组学显示了对免疫治疗反应的态势,免疫治疗反应与线粒体脂质代谢丰富有关,高线粒体代谢导致更高的抗原呈递和IFN信号传导,敲除β-氧化基因可降低黑色素瘤对T细胞杀伤的敏感性。

    总之:本研究运用了蛋白质组学分析,揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗反应之间的关联,这可能是将来改善治疗反应的基础。

原文:Michal Harel et al, Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence, Cell (2019).
DOI: 10.1016/j.cell.2019.08.012