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串联亲和纯化(TAP)-鉴定互作蛋白质
串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)技术基本原理包括:重组构建带有两种亲和纯化标签的融合靶蛋白,然后转染到宿主细胞或组织,带标签的靶蛋白表达并结合上相关蛋白质后,利用标签与相应磁珠作用,两步纯化得到相关蛋白质。
 
TAP技术的主要优点:①可以在细胞生理状态下或者接近生理状态表达融合靶蛋白,研究靶蛋白及其未知的相关蛋白复合体,更真实地反映蛋白质在生物体内的功能;②经过两次洗脱,降低了非特异蛋白量,相比较于酵母双杂交更敏感,更少假阳性.TAP技术属于蛋白质组学中“Bottom-up”策略之一,对研究蛋白质功能有很强的实用性。TAP技术联合质谱对纯化后的蛋白质进行分析,通过生物信息学获得的蛋白相关性可信度高,为后续的验证工作节省大量时间。TAP联用质谱,以检测在细胞内与FGF1分子相互作用的蛋白质为例,实验过程如下:
 
 

质谱鉴定实验流程(胶内酶解或溶液内酶解)
1:胶内酶解

2:溶液内酶解
  
 
使用仪器
Thermo Scientific Q Exactive 
(高分辨质谱)


技术优势
适合中度复杂的蛋白质样品, 如相互作用的蛋白质条带和洗脱液; 高准确性, 高灵敏度。


实验报告内容
1、相互作用蛋白质谱鉴定结果(excel 列表);
2、完整的实验步骤、使用仪器、试剂来源、软件检索参数等。
 
蛋白样品送样要求

样品 样品要求
SDS-PAGE条带 考染,条带清晰可见
蛋白质溶液 蛋白质总量>5μg,浓度>0.1μg/μl;
说明裂解液和洗脱液成分,浓度信息
 

                                 
实验样本预处理及运输注意事项
为保证高质量的技术服务结果,请您参照以下说明对实验样本进行处理和保存:
⊙蛋白洗脱液:定量并计算总蛋白量,真空干燥后,密封好管口,冰袋包装寄送。
⊙蛋白质条带(考染):从凝胶上割取条带时,避免污染,将条带放入EP管内,密封好管口,冰袋包装寄送。
特别提醒:快递寄送样本运输过程中,可能晃动幅度会比较大,请做好基本运输防护措施。
注:在寄送样本时,请填写好样本登记表,随样本一同寄往本公司。
 

参考文献:

Jayantha Gunaratne, et al. (2011) Protein Interactions of Phosphatase and Tensin Homologue (PTEN) and Its Cancer-associated G20E Mutant Compared by Using Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture-based Parallel Affinity Purification.  JBC, VOL. 286, NO. 20, pp. 18093–18103

Cezary Waszczak, et al.  (2014) Sulfenome mining in Arabidopsis thaliana. PNAS,  vol. 111,  no. 31, 11545–11550

Theresia D. et al. (2016) The neurofibromin recruitment factor Spred1 binds to the GAP related domain without affecting Ras inactivation.  PNAS, Vol. 113 no. 27.  7497–7502
 
Zhen C, et al. (2016) Proteomic Analysis Reveals a Novel Mutator S (MutS) Partner Involved in Mismatch Repair Pathway, Molecular & Cellular Proteomics, 15, 1299-1308. 
 
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